Реакция торможения миграции лейкоцитов в крови (миграция с конканавалином А (КонА))

Диагностика лекарственной аллергии. Лабораторные методы (in vitro)

Диагностика

В диагностике лекарственной аллергии выделяют следующие основные моменты:

• сбор аллергологического анамнеза;
• методы диагностики лекарственной аллергии in vitro (лабораторная диагностика);
• методы диагностики лекарственной аллергии in vivo (провокационные тесты на больном).

Сбор аллергологического анамнеза является важным этапом в диагностике лекарственной аллергии. Необходимо уточнить:

1. страдает ли сам больной или его родственники какими-либо аллергическими заболеваниями;
2. есть ли профессиональный контакт с медикаментами;
3. были ли прежде аллергические реакции на лекарственные препараты, через какой интервал времени после приема они развивались (быстрые/замедленные). Необходимо выяснить характер этих реакций конкретно на каждый препарат (укладываются ли они в представления об аллергических реакциях или относятся к другим нежелательным реакциям);
4. возникали ли аллергические реакции от применения наружных средств (лечебных мазей, кремов и других форм), которые могут быть обусловлены как лекарствами, входящими в их состав, так и мазевой основой или консервантами, красителями;
5. как пациент переносил вакцинацию и введение лечебных сывороток, препаратов крови;
6. отмечается ли повышенная чувствительность к бытовым, пыльцевым, пищевым, эпидермальным аллергенам, косметическим средствам и др.;
7. менялись ли аллергические проявления с течением времени (локальные проявления или трансформация в полисистемную реакцию).

Лабораторные методы диагностики лекарственной аллергии (in vitro)

Необходимо сразу отметить, что даже с позиций сегодняшнего дня ни лабораторная диагностика, ни кожное тестирование не дает 100% гарантии отсутствия или наличия лекарственной аллергии при применении конкретного препарата. Это объясняется тем, что в большинстве случаев лекарственная аллергия развивается не на исходный медикамент, а на продукты его метаболизма, механизмы формирования аллергических реакций также разнообразны и не подтверждаются неким одним универсальным методом. Наконец, в ряде случаев в формировании нежелательной реакции, внешне похожей на аллергическую, вовсе нет иммунных механизмов (псевдоаллергия). Поэтому отрицательный результат проводимого обследования может свидетельствовать только о низком риске развития аллергии при использовании данного лекарственного препарата.

Общим показанием для лабораторной диагностики является необходимость назначения лекарственного средства при:

• наличии в анамнезе аллергических заболеваний;
• тяжелых проявлениях лекарственной аллергии (шок и т. д.) в анамнезе;
• подозрении на профессиональную лекарственную аллергию;
• непереносимости лекарств и исключения аллергической реакции на медикамент;
• обширных поражениях кожи и невозможности выполнить кожные пробы;
• необходимости обследования на фоне приема антигистаминных препаратов и высоких доз глюкокортикостероидов (ГКС).

Лабораторные методы диагностики направлены на выявление:

• специфических IgE;
• сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

Ранее в диагностике лекарственной аллергии II и III типов важная роль отводилась выявлению специфических IgG и IgM, однако проведенные в последние годы исследования показали их низкую ценность, поскольку они выявляются у каждого принимавшего лекарственный препарат и являются результатом иммунного ответа организма, а не критерием диагностики лекарственной аллергии.

Кроме того, с позиций сегодняшнего дня достоверность старых иммунологических методик (реакция дегрануляции тучных клеток, РПГА и др.) в аллергологии подвергается большому сомнению, поскольку множество внешних и внутренних факторов способны оказать влияние на конечный результат исследования.

В лабораторной диагностике реакций I типа (IgE-зависимых) используют:

1. определение специфических IgE к определенным медикаментам методом иммуноферментного анализа (ИФА) или радиоаллергенсорбентного теста (РАСТ) с использованием специальных наборов для диагностики лекарственной аллергии «Аллергодиски»;
2. определение медиаторов аллергического воспаления (гистамина, триптазы, лейкотриенов) в периферической крови, назальных и бронхиальных секретах и моче. Необходимо отметить, что уровень гистамина в сыворотке крови повышен только в течение первого часа после острой аллергической реакции, а затем он приходит к норме. Повышение уровня триптазы в крови не всегда специфично и выражено через 1 и 6 часов от начала аллергии;
3. методику CASTs (с целью диагностики лекарственной аллергии), в которой с помощью проточного цитофлюоресциметра определяются активированные базофилы, несущие специфические антигены CD64+ и CD203. К сожалению, из-за высокой стоимости данный метод широко не используется в нашей практике;
4. реакцию дегрануляции тучных клеток (РДТК). Используют сыворотку крови больных (содержащую IgЕ), тучные клетки крыс и исследуемые лекарственные аллергены. Если в исследуемой сыворотке есть специфические IgЕ против лекарственного агента, они связываются с аллергеном на поверхности тучной клетки, вызывая ее дегрануляцию. Реакцию оценивают микроскопически по изменению морфологии тучных клеток. Число дегранулировавших клеток сравнивают с контрольными образцами (в которых сыворотку больного смешивают с тучными клетками без добавления аллергенов). Реакция считается положительной, если разница дегранулировавших клеток в опытном и контрольном образцах составляет более 20%;
5. реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). РТМЛ in vivo является одновременно лабораторным (подсчет числа лейкоцитов в смывах из полости рта до и после контакта с аллергеном) и провокационным тестом (возможно появление микросимптомов аллергии). Реакция расценивается как положительная, если число лейкоцитов в смывах через 15-30 минут после контакта с аллергеном снижается в 2 или более раза.

Определение специфических IgE свидетельствует о возможности развития лекарственной аллергии I типа с тяжелыми последствиями. Достоверность результатов реакции дегрануляции тучных клеток и реакции торможения миграции лейкоцитов не превышает 60%, однако доступность и дешевизна не позволяют в наших условиях полностью отказаться от их использования.

В лабораторной диагностике реакций II типа (IgE-независимые):

1. определяют титр комплемента по 50% гемолизу эритроцитов (реакция диагностически значима при исследовании на пике клинических проявлений). В ходе цитотоксической реакции белки комплемента расходуются, титр комплемента снижается. В случае аллергической цитопении отмечаются изменения в анализе периферической крови;
2. реакция спецгемолиза также может помочь в выявлении виновника аллергической реакции цитотоксического типа, однако для этой методики характерна низкая специфичность.

В лабораторной диагностике реакций III типа (IgE-независимые) применяется:

1. выявление циркулирующих иммунных комплексов (существуют методики исследования состава иммунных комплексов, а также гистохимического выявления отложений иммунных комплексов в тканях после биопсии);
2. косвенным признаком иммунокомплексной реакции является снижение титра комплемента (он активируется и расходуется в ходе реакции III типа).

Диагностика лекарственной аллергии IV типа (IgE-независимые) состоит в:

• определении наличия сенсибилизированных лимфоцитов (реакция бласттрансформации лимфоцитов в присутствии тех или иных аллергенов с морфологическим учетом бластов), данный метод — один из немногих, который сегодня широко используется в развитых странах;
• исследовании продукции цитокинов лимфоцитами после контакта с вероятным аллергеном в реакции торможения миграции лейкоцитов.

________________

Вы читаете тему:

Современные представления о лекарственной аллергии (Артишевский С. Н., Барановская Т. В., Борушко А. И. Белорусская медицинская академия последипломного образования. «Медицинская панорама» № 9, октябрь 2009)

1. Понятие о лекарственной аллергии.
2. Этиология.
3. Патогенез.
4. Классификация. Генерализованные поражения.
5. Кожные проявления.
6. Диагностика. Лабораторные методы (in vitro).
7. Методы диагностики in vivo.
8. Лечение лекарственной аллергии.
9. Неотложная помощь при анафилактическом шоке.
10. Профилактика.

Источник

Реакция торможения миграции лейкоцитов в крови (миграция с фитогемагглютинином (ФГА))

Категория: Клеточный иммунитет

Единица измерения: %

Реакция торможения миграции лейкоцитов позволяет оценить способность Т-лимфоцитов к выработке лимфокинов в ответ на антигенную стимуляцию. Этот тест оценки функциональной активности Т-лимфоцитов может быть использован для диагностики иммунологической недостаточности (реакция с митогенами), гиперчувствительности (аллергии) замедленного типа (реакция со специфическим Аг или аллергеном). Реакция торможения миграции лейкоцитов может быть также использована для выявления иммунного ответа на возбудителей инфекций, для определения степени гистосовместимости и при опухолевых процессах.

Подробное описание

Этот тест характеризует активность воспалительного процесса. Увеличение реакции торможения миграции лейкоцитов следует рассматривать как прогностически благоприятный фактор; клинически это сопровождается более быстрым выздоровлением больных острыми хирургическими заболеваниями после оперативного вмешательства и укорочением послеоперационного периода. Торможение миграции лейкоцитов может быть очень значительным при аллергических реакциях.

Референтные значения

Факторы повышения и понижения

Источники и литература

Источник

Реакция торможения миграции лейкоцитов в крови (миграция с конканавалином А (КонА))

Категория: Клеточный иммунитет

Единица измерения: %

Реакция торможения миграции лейкоцитов позволяет оценить способность Т-лимфоцитов к выработке лимфокинов в ответ на антигенную стимуляцию. Этот тест оценки функциональной активности Т-лимфоцитов может быть использован для диагностики иммунологической недостаточности (реакция с митогенами), гиперчувствительности (аллергии) замедленного типа (реакция со специфическим Аг или аллергеном). Реакция торможения миграции лейкоцитов может быть также использована для выявления иммунного ответа на возбудителей инфекций, для определения степени гистосовместимости и при опухолевых процессах.

Подробное описание

Этот тест характеризует активность воспалительного процесса. Увеличение реакции торможения миграции лейкоцитов следует рассматривать как прогностически благоприятный фактор; клинически это сопровождается более быстрым выздоровлением больных острыми хирургическими заболеваниями после оперативного вмешательства и укорочением послеоперационного периода. Торможение миграции лейкоцитов может быть очень значительным при аллергических реакциях.

Референтные значения

Факторы повышения и понижения

Источники и литература

Источник

Реакция миграции лейкоцитов

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

Реакция миграции лейкоцитов

Принцип.

Подвижность лейкоцитов периферической крови, их миграция к очагам тканевой деструкции, хемотаксис к ауто- и гетероантигенам, перераспределение между лимфоидными органами при стрессорно-адаптивных реакциях являются составляющей компонентой общей системы реактивности, способности к сохранению постоянства внутренней среды.

Сенсибилизированные к определенному антигену лимфоциты резко снижают скорость подвижности в среде, в которую вносят этот антиген. Реакция осуществляется при непосредственном взаимодействии антигенспецифических рецепторов с антигеном, а также через воздействие фактора, ингибирующего миграцию клеток, выделяющегося при контакте со специфическим антигеном. Этот феномен позволяет продемонстрировать органоспецифическую клеточно-опосредованную гиперчувствительность.

Реакция торможения миграции агармиграционным тестом.

Приборы и оборудование.

1. Пластиковые или стеклянные чашки диаметром 50 мм.
2. Пробойники для агара диаметром 2,5 мм.
3. Проекционный аппарат «Микрофот» типа 5ПО-1.

Реактивы.

1. Агар-агар (способ приготовления и очистки см. выше).
2. Трис-хлоридный буфер рН 7,3.
3. Среда 199.
4. Сыворотка крупного рогатого скота.
5. Гепарин.
6. Антибиотики (для консервации), нетоксичные для клеток.

Ход реакции.

3% агар-агар на изотоническом растворе натрия хлорида, забуференном трис-хлоридным буфером рН 7,3, охлажденном до 50 °С, добавляют к 10 мл смеси: 9 мл среды 199,1 мл сыворотки крупного рогатого скота, 3000 ЕД мономицина (смесь предварительно прогревают до 37 °С). Полученный гель разливают в чашки (если используются стеклянные, то их необходимо силиконировать), установленные строго горизонтально в количестве, необходимом для создания слоя толщиной 2 мм. В затвердевшем геле пробивают лунки (2,5 мм) в количестве, обусловленном опытом. Концентрацию антигена, которую необходимо внести в смесь, высчитывают опытным путем (по дозе, вызывающей наименьший разброс в повторных постановках) для каждого антигена и серии опытов. Выделение лейкоцитов. В пробирку помещают 10 мл гепаринизированной крови обследуемого (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). В течение 1 ч пробирку выдерживают в термостате 37 °С под углом 45°. Через 50 мин пробирки переводят в вертикальное положение и выдерживают еще 10 мин. После отстаивания плазму осторожно отсасывают и переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Примесь эритроцитов в клеточном осадке лизируют в гипотоническом растворе хлорида натрия, для чего к клеточному осадку добавляют 5 мл 0,35 % раствора и осторожно пастеровской пипеткой ресуспендируют клетки, не допуская образования пены, в течение 30-45 с. После экспозиции к суспензии клеток немедленно добавляют 0,6 мл 5 % раствора хлорида натрия и тщательно перемешивают. В результате раствор становится изотоничным. Полученную взвесь лейкоцитов трижды отмывают средой 199 или фосфатным буфером рН 7,4.

Контрольные и опытные исследования проводят в 4 параллельных лунках, внося в каждую из них по 5 мкл ресуспендированной лейковзвеси (1,5 млн. клеток). Через 20 ч инкубации чашек в термостате при 37 °С их заливают 10 % раствором формалина (в целях фиксации клеток). Через 4 ч слой агара осторожно удалают, чашки промывают и высушивают. Результаты учитывают путем проектирования полей миграции на бумагу с помощью аппарата «Микрофот». Индекс миграции (И) определяют по расчету соотношения величин площадей миграции в опыте и контроле по формуле:

где Д20 — средний диаметр 4 зон миграции в опыте; Д2К — средний диаметр 4 зон миграции в контроле; д20 — средний диаметр 4 центральных лунок в опыте; д2К — средний диаметр 4 центральных лунок в контроле.

Реакция торможения миграции лейкоцитов в прямом капиллярном тесте.

Выделение лейкоцитов проводят аналогично описанному выше. Выделенные лейкоциты ресуспендируют в 0,1 мл среды 299 или фосфатного буфера. Этой клеточной взвесью заполняют стеклянные капилляры с внутренним диаметром 0,7 мм и длиной 12 см (капилляры необходимо точно калибровать, так как от этого зависит стандартизация объемов клеточной взвеси). С одного конца капилляр запаивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Концы капилляров, содержащие клетки, нарезают кусочками по 5- 6 мм и погружают в стеклянные камеры, заполненные средой 199, закрепляя их в центре с помощью вазелина, предварительно нанесенного на дно камеры. Камеру герметически закрывают (притирают с вазелином) покровным стеклом и помещают в термостат при 37 °С на 20 ч в строго горизонтальном положении. Оба конца капилляра открыты (камеры готовят из стеклянных колец 20Х10Х2 мм, фиксированных на предметных стеклах смесью воск-парафин). Концентрацию вносимого антигена рассчитывают экспериментально и определяют в мкг/мл по концентрации белка. На каждую концентрацию антигена и контроль используют по 2 капилляра и соответственно получают 4 зоны миграции. Измерение зон миграции, исчисление их площади проводят различными способами. Наиболее распространен метод проектирования чашек (камер) с мигрирующими лейкоцитами, образующими облачко над капилляром, с использованием фотопроектора на миллиметровую бумагу или фотопленку. Проекцию зоны миграции обводят карандашом и высчитывают планиметром или (при использовании рентгеновской пленки) вырезают и взвешивают. Индекс миграции (И) определяют по формуле:

Приготовление и очистка антигенов достаточно полно отражены в ряде руководств (см. рекомендованную литературу).

Клиническое значение.

Выявление сенсибилизированных к определенному антигену лимфоцитов говорит об участии этого антигена в развитии специфической гиперчувствительности и в ряде случаев может быть использовано в диагностике опухолей, гломерулонефрита, дифференциальной диагностике неспецифических миокардитов и кардиопатий.

Литература.

1. Петров Р. В. Иммунология.- М.: Медицина, 1982;
2. Руководство по иммунологии / Под ред. О. Е. Вязова, Ш. X. Ходжаева.-М.: Медицина, 1973;
3. Лимфоциты. Выделение, фракционирование и характеристика / Под ред. Д. Натвига, П. Перлмана, X. Вигзеля.- М.: Медицина, 1980.

Источник